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Exonuclease III是一种核酸外切酶，该酶作用于双链DNA，从3'-OH末端方向逐步切去单核苷酸。Exonuclease III也有RNase H、3'-磷酸酶和脱嘌呤/嘧啶-核酸内切酶活性。

该酶最适底物是平末端或5'末端突出的DNA，但也可以作用于双链DNA切刻位点产生单链缺口。由于对单链DNA无活性，因此该酶难以切割3'突出末端。3'到5'外切酶活性对底物的消化程度随3'突出末端的长度而变化，四碱基或更长的突出末端难以被切割。这种特性可以用于生产特定方向的单链DNA，将线性化DNA设计成为一端为不切割末端（3'突出端），另一端则设计为易切割末端（平端或5'突出端），此时Exonuclease III将仅消化一条链。

• 单向嵌套缺失。
  
• 定点突变。
  
• 单链特异性探针的制备。
  
• 双脱氧测序用单链底物的制备。

• 于冰上配置如下反应体系
  

  成分	用量
  DNA	~5μg
  10×Exo III Buffer	5μL (1×)
  Exonuclease III	0.5μL
  Nuclease-Free Water	至50μL

• 37℃孵育30分钟；
  
• 加入终浓度为11mM的EDTA以停止反应；
  
• 热失活条件为70℃孵育30min；
  
• 建议采用以下步骤回收处理后的样本：
  
  • 使用PCR柱清洁；
    
  • 进行琼脂糖凝胶电泳，然后胶回收DNA；
    
  • 进行苯酚/氯仿萃取，后使用乙醇沉淀。